数字PCR测量实验结果

比对样品的均匀性和稳定性
比对样品均匀性统计如图1。F检验结果和均匀性引入的不确定度。经统计分析表明，比对样品均匀性良好，满足开展比对要求。
比对样品参考值确定和不确定度评定
对参比实验室提交的拷贝数浓度结果进行分析后，发现7家实验室结果显著偏低，且提交的一维散点图阳性微滴扩增非常弥散，推测这些实验室测量时未对质粒样品进行酶切，这会导致拷贝数浓度测量结果显著偏低，经与参比实验室沟通证实了推测。因此这7家参比实验室的结果，不参与比对参考值的计算。

参比实验室6虽未进行酶切，但从一维散点图看，阳性微滴和阴性微滴之间没有弥散，因此选择了包括该实验室在内的9家参比实验室的平均值作为参考值。
将外源基因片段和内源基因片段比值的理论值1.00作为拷贝数比值的参考值，不确定度为2.0%。

参考值的不确定度包括方法的不确定度、均匀性和稳定性的不确定度，其中方法的不确定度分量包括测量结果重复性、移液器和微滴体积[4]引入的不确定度。均匀性和稳定性引入的不确定度均按照JJF-1343-2012进行统计分析，具体的结果见表3。

参比实验室测量结果
16家实验室对外源基因与内参基因拷贝数比值的分布范围为0.9996～1.0500，与参考值的偏差在5%以内，不同的颜色表示不同的平台，橙色：伯乐QX200；绿色：BioDigital青；红色：Quantstudio 3D；紫色：Drop Maker M1、Chip Reader R1；蓝色：Accu ONE；灰色：SG-2000、Dscanner4-1000；黄色： MicroDrop-100），这表明所有参比实验室，在采用数字PCR进行基因拷贝数比值测定时，都可以实现准确测定。该结果同时也证明酶切与否并不影响拷贝数比值的测定，但却显著影响质粒DNA的绝对拷贝数测量结果。
参比实验室对转基因内、外源基因拷贝数浓度结果的分散性较大，最低测量结果和最高测量结果之间相差近5倍。分析其主要原因是该样品为环状质粒，8家参比实验室进行测量前没有进行线性化，其中7家实验室的一维散点图，阳性微滴的扩增非常弥散，这会严重影响对质粒DNA的准确定量，而这7家参比实验室测定的结果均显著低于酶切实验室的结果，这一发现和我们之前的研究结果一致[4,20]。

参比实验室6虽然也未进行酶切线性化，但从该实验室提供的一维散点图看，不存在弥散现象，这和所使用的PCR扩增过程中的聚合酶有关，我们在CCQM P154国际比对，以及与韩国计量院开展的双边比对研究中发现，有些聚合酶对质粒的构象并不敏感，可以获得与线性化后一致的结果[21]。因此建议在采用数字PCR进行质粒DNA定量时，应首先根据一维散点图判断是否需要酶切，如果过度弥散，应采用限制性内切酶进行酶切后，再进行数字PCR定量测量。

16家参比实验室共使用了7种不同的数字PCR平台，在非酶切的参比实验室结果中，如参比实验室2、12和7使用了不同的数字PCR平台，其测量结果和与使用QX200平台的参比实验室14、15、11没有显著差异。而在酶切的实验室结果中，参比实验室13、9、1、3、4和10均使用了QX200平台，其测量结果与参比实验室5和6相比，平台间的差异小于不同实验室的差异，而参比实验室8结果和其他平台相比偏高，推测该偏差来自实验室操作或系统误差，具体原因需要进一步的实验验证。此外，与非酶切相比，酶切会增加拷贝数测量结果的分散程度，这与酶切操作过程中引入的稀释倍数差异或酶切完全与否有关。因此，建议酶切过程中应对稀释倍数和酶切条件进行严格控制。

比对结果的评定
由于7家未酶切的实验室拷贝数浓度测量结果显著偏低，且没有用于计算比对的参考值，所以不对这7家实验室的拷贝数浓度进行Z'比分数评价，因酶切与否并不对拷贝数浓度比值产生显著影响，所以采用百分相对差D%对所有参比实验室的拷贝数比值进行评价。

对转基因质粒样品NK603基因拷贝数的测定，9家实验室的Z’比分数评价结果如图3所示，所有实验室的Z'值≤2，比对结果在合理的预期范围。对转基因质粒样品ZSSIIB基因拷贝数的Z’比分数评价结果如图3所示，9家实验室中有8家实验室的Z'值≤2，比对结果在合理的预期范围，其中有1家参比实验室的Z'值>2，比对结果与合理的预期结果有差距，结果可疑，建议该参比实验室进行核查。

对两个基因片段拷贝数的比值的测定，16家参比实验室D%结果分析表明，所有实验室都小于25%，符合预期（见表4）。

结论
数字PCR在转基因核酸定量中领域中具有重要应用，本次比对考查了16家参比实验室的数字PCR测量转基因质粒DNA样品的能力，转基因质粒DNA的外源基因与内源基因拷贝数比值的正确度都在可接受的范围里（<25%），没有发现不同数字PCR平台具有显著差异。但是，由于质粒DNA的内源和外源基因拷贝数受质粒构象的影响显著，拷贝数的结果差异较大，其中7个参比实验室对质粒DNA的绝对拷贝数测量结果显著低于参考值。使用数字PCR测定基因拷贝数浓度时，应根据不同类型的样品制定相应的标准操作流程，尤其是对质粒DNA进行定量测定时要考虑质粒构象的影响。