数字PCR测量实验方案和要求

主导实验室制定了比对实施方案，提供了比对所需的PCR引物探针及质粒DNA样品。要求各参比实验室采用数字PCR技术，测量未知样的目标基因拷贝数浓度和拷贝数比值。

参比实验室
16家参比实验室分别为上海仁东医学检验所有限公司、上海海关动植物与食品检验检疫技术中心、铭时医疗科技（宁波）有限公司、南京市计量监督检测院、中国科学院武汉病毒研究所、广东永诺医疗科技有限公司、上海市计量测试技术研究院、臻准生物科技（上海）有限公司、中国农业科学院生物技术研究所、新羿制造科技（北京)有限公司、农业农村部农产品及加工质量监督检验测试中心（天津）、北京市理化分析测试中心、农业农村部农产品及加工品质量安全监督检验测试中心（杭州）、苏州锐讯生物科技有限公司、中国测试技术研究院生物所、中国计量科学研究院，来自食品检验、公共安全、检验检疫、计量校准、仪器制造商等领域。

比对样品和试剂
比对样品为未知含量的环状转基因玉米NK603质粒DNA溶液，该质粒分子含有一个108 bp的转化体特异性基因片段和151 bp的ZSSIIB内标准基因片段。拷贝数含量范围为102～104 copies/μL。转基因质粒DNA的内源基因片段（ZSSIIB）和外源基因片段(NK603)比值的理论值为1：1。以冻存管密封包装，于?70℃保存。比对所需的引物探针均由主导实验室提供，比对样品和试剂均采用干冰运输。

比对样品均匀性：随机抽取7个单元，采用数字PCR方法，每管重复测量3次，通过方差分析法来检验样品均匀性。

比对样品稳定性：分别在0、0.1个月、6个月随机抽取3管，采样数字PCR方法，每管重复测量3次。长期稳定性依据JJF-1343-2012，通过线性拟合进行分析。

比对结果的评定
（1）拷贝数比值结果评价

根据国际上对转基因测量方法性能最低要求[19]，转基因拷贝数比值的正确度应在可接受的参考值的±25%以内，因此采用百分相对差评价拷贝数比值。

D%=Xi?X0X0×100
其中， Xi表示参比实验室的测量结果；X0表示参考值。

（2）核酸拷贝数浓度结果评价

采用Z’比分数对核酸拷贝数测量结果进行评价。将参比实验室的测量数据Xi按大小顺序排列。如数据排列结果为：X1≦X2≦?Xn，则某个实验室的Z’比分数值为:

Z′=Xi?X0s2+ux2???????√
其中，Xi表示参比实验室的测量结果；X0表示参考值；s表示所有参比实验室比对结果发散性的估计量；ux表示参考值的标准不确定度。

s采用标准化四分位间距（NIQR)作为结果发散性的量度：s = NIQR = IQR × 0.7413。式中，IQR为四分位间距。IQR是低四分位数值和高四分位数值的差值，IQR = Q3?Q1。其中，低四分位数值Q1是低于结果的四分之一处的最近值，高四分位数值Q3是高于结果四分之三处的最近值。

参比实验室结果的合格性评判原则：当|Z′|≦2时，比对结果在合理的预期范围之内；当2<|Z′|<3比对结果与合理的预期结果有差距，结果可疑，应分析原因；当|Z′|≧3，比对结果没有达到合理的预期，应分析原因。