荧光定量PCR仪校准方法与结果情况

荧光定量PCR仪校准方法与结果情况

实时荧光定量PCR仪特异性更强，自动化程度更高，且有效地解决了PCR污染的问题，应用领域及应用量都不断增加。但其设计更为复杂，温度模块和光学系统设计同时影响其性能和实验准确性，为定量PCR仪校准带来了巨大挑战。采用生物试剂等方式对定量PCR仪荧光部分校准缺乏溯源性，无法分析误差来源，存在较大缺陷。

PCR仪操作简单、灵敏度高，被广泛地应用于分子生物学中。但传统PCR仪不能准确定量，操作过程中易污染使得假阳性率高等缺陷。荧光定量PCR技术是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时监控整个PCR反应过程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。这一技术特异性更强，自动化程度更高，且有效地解决了PCR污染。

因此，实时荧光定量PCR仪逐步取代普通PCR仪在临床检验、检验检疫、法医鉴定、疾病控制、体外诊断试剂制造和研发、生物技术产品研发等领域得到了更为广泛的应用。荧光定量PCR仪在普通PCR仪的技术上增加了荧光激发装置和检测系统，包含激发光光源、滤光片、镜头和荧光检测器等。检测系统有超低温ＣＣＤ成像系统和光电倍增管ＰＭＴ。

荧光定量PCR仪光学校准方法与结果分析的性能起到决定性控制作用，共同决定最终实验结果的准确性和可靠性。因此，对定量PCR仪的校准需求也逐步从单纯的温场校准转向温度加荧光的复合参数校准。

１，荧光定量PCR仪校准现状

相对于传统PCR仪，荧光定量PCR仪的影响因素更为复杂，主要因素包含化学试剂、温度模块的温度因数、顶盖温度因数、镜头、反光镜和光路通道、荧光接收器的敏感度、机械组成部分、荧光信号处理软件的阈值设定，如基线，基线设定，Ｓ／Ｎ比例探测等，这就为荧光定量PCR仪的校准带来了巨大的挑战。

国内校准机构目前针对荧光定量PCR仪的校准主要分为两种情况：

一种是仅对荧光定量PCR仪的温场部分进行校准，这种方法无法对荧光定量PCR仪光学部分进行校准，所获得的结果不能对荧光定量PCR仪的性能进行全面评估；

另外一种方法是利用化学试剂对荧光定量PCR仪的进行荧光检测，这种方法同样存在极大缺陷。首先采用化学方法对定量PCR仪荧光系统进行校准，无法溯源到任何公认的标准，不具备溯源性。其次，梯度稀释试剂的过程中由于人为操作会引入一定的误差，误差值可能较大，直接影响到最终的检测结果。最重要的是，采用这种方法进行校准，无法说明荧光定量PCR仪的温度和荧光对最终定量结果的影响关系，误差多少及误差来源等。

随着定量PCR仪的应用越来越广泛，使用者迫切需要对荧光定量PCR仪的性能进行评估。在现有检测手段无法满足需求的情况下，荧光定量PCR仪使用者普遍采用两种方式自行对仪器状态进行判断，一种是使用生物试剂测试盘这种检测方法和采用已知浓度的质粒ＤＮＡ标准物质对样本线性误差进行校准的方法都属于化学方法，这种方法仅能够针对孔与孔间的组合线性进行测量，所得结果仅能代表PCR仪孔与孔间的平均结果，不能代表单孔的线性，无法真实反映仪器的性能。另一种方法是采用多台不同厂家或型号定量PCR仪实验比对的方式来比较不同仪器间的系统误差，判断系统误差是否在临床接受范围内。这种方法既不具备溯源性，又需要对单个项目进行实验比对，成本较高。

影响定量PCR仪结果重复性的２个主要原因是边缘效应和实验误差，而边缘效应是由于光路设计缺陷和控温模块缺陷导致的。如果光路设计存在缺陷，会导致PCR仪样品槽的边缘孔和中间孔光程存在差异，不同反映孔间荧光基团获得的激发光能量存在差异，最终影响实验结果。同时，加热模块的空间温差同样会导致这种边缘效应，研究表明，孔间温差的微小差别可能在基因扩增的过程中被指数级放大，最终影响实验结果。此外，光路设计缺陷和孔间温差的存在还会直接影响到熔解曲线的结果，使得不同仪器对熔解曲线的分辨率存在明显差异。在通过熔解曲线检测突变或进行单核苷酸多态性分析时，这种影响会导致无法成功区分突变基因或误判突变基因。

因此，对定量PCR仪更加全面科学的校准方式是采用可溯源物理手段同时对荧光定量PCR仪的温度部分和光学部分进行校准，并分析二者之间的联系，以保障实验结果的准确性。

２，定量PCR仪光学校准系统

基于上述定量PCR仪校准需求，本文采用Cyclertest3Doptical定量PCR仪光学校准系统对定量PCR仪的温场和荧光系统进行全面校准。系统在原有的PCR仪温度校准系统基础上运用可溯源光谱理论，将温度和荧光检测相结合，模拟定量PCR仪试验，不仅可以对温度模块、上盖温度进行检测，还能同时对荧光系统进行检测，并分析而二者的相关性，更准确地确定定量PCR仪误差及误差来源。

前端传感器示意图检测系统镶嵌经校准并可用光谱仪溯源的发光LEG，通过给定电流量的不同会产生不同区强度的荧光模拟标准荧光激发，并通过对荧光激发部分的温度控制。

这种设计避免了光谱的漂移，保证LEG的激发光在运行过程中保持绝对的同一水平，这种采用物理手段进行检测，避免了人为操作引入的误差，更加准确。这种荧光检测方法通过了国际认证，运用了可溯源光谱理论，可溯源温度计量来对荧光定量PCR进行完全的检测，系统根据溯源性、可靠性和准确性。

系统温度部分可以对定量PCR仪的温度准确度、孔间温差、实时升温速率、实时降温速率、温度过冲、温度持续时间、上盖温度进行校准。荧光部分可以对定量PCR仪的Ｃｑ（Ｃｔ）相差值、精确度、荧光饱和值、荧光线性、熔解曲线精确度及一致性，熔解温度的比例关系及线性灵敏度等进行检测。